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    猪瘟病毒巢式RT-PCR检测试剂盒

    发布时间:2014-01-06 15:10:03

    包装规格:10头份/盒;20头份/盒;

    用途

    猪瘟病毒(CFSV)巢式反转录聚合酶链式反应(nRT-PCR)检测试剂盒,用于检测疑似感染动物的血清或组织中的猪瘟野毒株病毒(CFSV),适用于CFSV的检测、诊断和流行病学调查。

    原理

    利用离心柱内硅基质膜提取RNA,在反转录酶的作用下,以 RNA为模板,引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在 TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异 DNA片段的拷贝数放大一倍。本试剂盒采用巢式PCR方法,经过第一次扩增循环32次,第二次扩增循环35次,增加了检测的敏感性和可靠性,最终使扩增 DNA片段放大了数百万倍。再将扩增 DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照下,肉眼可见到 DNA片段的扩增带。本方法通过巢式RT-PCR扩增,利用引物的特异性降低了扩增多个靶位点的可能性,可以特异性地从组织样品中检测出猪瘟野毒株病毒。

    试剂盒组成

    *洗液Ⅰ首次使用前,请添加2.5ml10头份)/5ml20头份)100%乙醇。

    *洗液首次使用前,请添加7ml10头份)/14ml20头份)100%乙醇。

    需要自备的器材及试剂

    器材:PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪、可调移液器(2.5µl10µl200µl1000µl)、离心机、微波炉、一次性RNase Free吸头(10µl200µl1000µl)、RNaseFree 1.5ml离心管、0.2mlPCR管。

    试剂:琼脂糖、Marker、核酸染色液、TAE电泳缓冲液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

    使用注意事项

    所有接触病料的物品均应合理处理,以免造成人员伤害及污染实验室。

    所有试剂应在规定的温度储藏,-20℃保存的各试剂使用前应放于室温完全融化,使用后立即放回-20℃。

    严格遵守操作说明可以获得良好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

    反复冻融试剂将减低检测灵敏度,建议在3次内用完,请严格按照试剂盒说明书操作。

    样品制备

    1样品采集:病死或扑杀的猪,取扁桃体、淋巴结、脾脏等组织病变部与健康部交界处组织;待检活猪,用注射器取血5ml28℃保存,送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)

    2样品处理:每份样品分别处理。

    2.1组织样品处理:每份组织样品分别从三个不同的位置称取约3g,用手术剪剪碎混匀后,按照1:4加入PBS液于研磨器中研磨,匀浆后48000×g离心2min,取上清液200µl1.5ml灭菌离心管(自备)中。

    2.2全血样品处理:待血凝后取血清200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

    2.3阳性对照处理:取阳性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

    2.4阴性对照处理:取阳性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

    操作步骤

    1 病毒RNA提取

    1.1 取已处理的样品、阳性对照和阴性对照,分别加入200µl试剂Ⅰ,剧烈震荡混匀,室温放置3-5min

    1.2 加入75µl试剂Ⅱ,混合均匀后,412000×g离心3-5min

    1.3 将上清液转移到新的2ml 收集管中,加入300µl 异丙醇,上下颠倒混匀。

    1.4 将混匀液转移至吸附柱中(提前将吸附柱安置于另一新的2ml收集管中),412000×g离心1min,弃滤液。注:若吸附柱中有液体残留,可重复离心1 min

    1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中,412000×g离心1min,弃滤液。

    注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中,412000×g离心1min,弃滤液。将吸附柱放回收集管中,412000×g离心1min

    注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

    1.7将吸附柱安置于新的1.5ml的离心管(自备)中,在吸附柱膜的中央处加入50µl洗脱液,室温静置3 min412000×g离心1min洗脱病毒RNA注:溶解的RNA应置于-20℃或者更低温度环境下保存。

    2 RT-PCR操作程序

     

    第一次扩增:25µl体系,使用前每份中分别加入21µl RT-PCR反应液、1µl酶混合液和3µl1.7”中提取的模板RNA(注:使用时可根据情况适当稀释),混匀后按照右侧程序进行PCR扩增:


    第二次扩增:25µl体系,使用前每份中分别加入22µl PCR反应液和3µl第一次扩增产物,混匀后按照右侧程序进行PCR扩增:

     

     

    3 电泳

    2g琼脂糖于250ml锥形瓶中,加入TAE电泳缓冲液200ml,于微波炉中熔解,再加入10µl核酸染色液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物10µlMarker适量点样于琼脂糖凝胶孔中,以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳30min,紫外灯下观察结果。

    结果判定

    阳性对照在272bp处出现扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品在在272bp处出现扩增带为猪瘟野毒株病毒阳性,否则为阴性。

     

    附:本试剂盒A盒中附赠的TAE电泳缓冲液,使用时用双蒸水或去离子水50倍稀释后使用。


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