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    猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒

    发布时间:2014-01-23 13:59:21

    用途

    猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测试剂盒,用于检测疑似感染动物的血清或组织中的PRRSV,适用于PRRSV的检测、诊断和流行病学调查。

    原理

    利用离心柱内硅基质膜提取RNA,在反转录酶的作用下,以 RNA为模板,引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在 TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异 DNA片段的拷贝数放大一倍。经过 35次循环,最终使扩增 DNA片段放大了数百万倍。将扩增 DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到 DNA片段的扩增带。

    试剂盒组成

    名称

    组分

    10头份

    20头份

    贮藏条件

    A

    (核酸提取)

    吸附柱(Spin Column

    10(支)

    20(支)

    室温

    12个月

    2ml收集管(Collection Tube

    20(支)

    40(支)

    试剂Ⅰ(Reagent Ⅰ)

    2.4ml

    4.4ml

    试剂Ⅱ(Reagent Ⅱ)

    800μl

    1.6ml

    异丙醇(Isopropanol 

    5mL

    8ml

    洗液Ⅰ* Rinse Ⅰ)

    3.5ml

    7ml

    洗液Ⅱ* Rinse Ⅱ)

    3ml

    6ml

    洗脱液(Elution Buffer

    600μl

    1.1ml

    B

    RT-PCR检测)

    阳性对照(Positive Control

    600μl

    1ml

    -20

    6个月

    阴性对照(Negative Control

    600μl

    1ml

    RT-PCR反应液(RT-PCR reaction solution

    231μl

    462μl

    酶混合液(Mixture enzyme

    11μl

    22μl

    *洗液Ⅰ首次使用前,请添加2.5ml10头份)/5ml20头份)100%乙醇。

    *洗液Ⅱ首次使用前,请添加7ml10头份)/14ml20头份)100%乙醇。

    需要自备的器材及试剂

    器材:PCR扩增仪、电泳系统、紫外凝胶成像仪、可调移液器(2.5µl10µl200µl1000µl)、离心机、微波炉、一次性RNase Free吸头(10µl200µl1000µl)、RNase Free 1.5ml离心管、0.2mlPCR管。

    试剂:琼脂糖、Marker、核酸染色液、TAE电泳缓冲液、PBS液(0.01M,pH7.2-7.4)。

    使用注意事项

    所有接触病料的物品均应合理处理,以免造成人员伤害及污染实验室。

    所有试剂应在规定的温度储藏,-20℃保存的各试剂使用前应放于室温完全融化,使用后立即放回-20℃。

    严格遵守操作说明可以获得良好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

    反复冻融试剂将减低检测灵敏度,建议在3次内用完,请严格按照试剂盒说明书操作。

    样品制备

           1样品采集:病死或扑杀的猪、死亡胎儿等,取肺、扁桃体、脾脏和淋巴结等组织;待检活猪,用注射器取血5ml28℃保存,送实验室检测。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)

    2样品处理:每份样品分别处理。

    2.1组织样品处理:每份组织分别从三个不同位置称取样品约3g,用手术剪剪碎混匀后,按照1:4加入PBS液于研磨器中研磨,匀浆后48000×g离心2min,取上清液200µl1.5ml灭菌离心管(自备)中。

           2.2全血样品处理:待血凝后取血清200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

           2.3阳性对照处理:取阳性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

           2.4阴性对照处理:取阴性对照200µl,置1.5ml灭菌离心管(自备)中。

     

    操作步骤

           1 病毒 RNA提取

           1.1 取已处理的样品、阳性对照和阴性对照,分别加入200µl试剂Ⅰ,剧烈震荡混匀,室温放置3-5min

           1.2 加入75µl试剂Ⅱ,混合均匀后,4 12000×g离心3-5 min

           1.3 将上清液转移到新的2ml收集管中,加入300µl异丙醇,上下颠倒混匀。

        1.4 将混匀液转移至吸附柱中(提前将吸附柱安置于另一新的2ml收集管中),4 12000×g离心1 min,弃滤液。注:若吸附柱中有液体残留,可重复离心1 min

            1.5 加入500µl洗液Ⅰ至吸附柱中, 4 12000×g离心1 min,弃滤液。

        注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

        1.6 加入800µl洗液Ⅱ至吸附柱中,4 12000×g离心1 min,弃滤液。将吸附柱放回2ml收集管中,4 12000×g离心1 min注:请确认洗液中已经加入了指定体积的100%乙醇。

        1.7 将吸附柱安置于新的1.5ml的离心管(自备)中,在吸附柱膜的中央处加入50µl洗脱液,室温静置3 min4 12000×g离心1 min洗脱病毒RNA注:溶解的RNA应置于-20℃或者更低温度环境下保存。

           2 RT-PCR操作程序

       25µl体系: 使用前每份中分别加入21µl RT-PCR反应液、1µl酶混合液和3µl1.7”中

             提取的模板RNA(注:使用时可根据情况适当稀释),混匀后按照以下程序进行PCR扩增:

    50     30min

    95     3min

    94     50s

    55     50s       35个循环

    72     1min

    72     10min

       3 电泳

    2g琼脂糖于250ml锥形瓶中,加入TAE电泳缓冲液200ml,于微波炉中熔解,再加入10µl核酸染色液混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物10µlMarker适量点样于琼脂糖凝胶孔中,以110-120V电压于TAE电泳缓冲液中电泳30min,紫外灯下观察结果。

      结果判定

    阳性对照在421bp511bp处出现扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品在421bp处出现扩增带为猪繁殖与呼吸综合征变异株病毒阳性,或在511bp处出现扩增带为猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株阳性,否则为阴性。

     附:本试剂盒A盒中附赠的TAE电泳缓冲液,使用时用双蒸水或去离子水50倍稀释后使用。

     


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